ISOLASI DNA PADA BAKTERI

ISOLASI DNA PADA BAKTERI

Isolasi DNA

DNA dapat diisolasi, baik pada manusia maupun pada tumbuhan. DNA manusia dapat diisolasi melalui darah. Darah manusia terdiri atas plasma darah, globulus lemak, substansi kimia (karbohidrat, protein dan hormon), dan gas (oksigen, nitrogen dan karbon dioksida). Plasma darah terdiri atas eritrosit (sel darah merah), leukosit (sel darah putih) dan trombosit (platelet). Komponen darah yang diisolasi yaitu sel darah putih. Sel darah putih dijadikan pilihan karena memiliki nukleus, di mana terdapat DNA di dalamnya.

Isolasi DNA memiliki beberapa tahapan, yaitu: isolasi jaringan, dinding dan membran sel dilisiskan, diekstraksi dalam larutan, dipurifikasi, dan dipresipitasi. Prinsip-prinsip dalam melakukan isolasi DNA ada 2, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas. Teknik sentrifugasi tersebut dilakukan di dalam sebuah mesin yang bernama mesin sentrifugasi dengan kecepatan yang bervariasi, contohnya 2500 rpm (rotation per minute) atau 3000 rpm.

  Ada 5 tahap untuk melakukan isolasi DNA, yaitu: isolasi jaringan, pelisisan dinding dan membran sel, pengekstraksian dalam larutan, purifikasi, dan presipitasi. Tahap pertama yang dilakukan yaitu mengisolasi jaringan yang ingin digunakan, yaitu darah. Tahap selanjutnya yaitu melisiskan dinding dan membran sel dengan larutan pelisis sel darah merah. Setelah dilakukan inkubasi, darah yang telah bercampur dengan pelisis sel darah merah tersebut lalu disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 2500 rpm. Selanjutnya supernatan yang terbentuk dibuang dan kemudian dilakukan ekstraksi di dalam larutan. Hal tersebut bertujuan agar didapat ekstrak nukleus sel darah putih. Tahap berikutnya adalah purifikasi. Tahap ini bertujuan untuk membersihkan sel darah putih dari zat-zat lainnya, dan tahap terakhir, yaitu presipitasi bertujuan untuk mengendapkan protein histon, sehingga untai-untai DNA tidak lagi menggulung (coiling) dan berikatan dengan protein histon, yang menyebabkan DNA menjadi terlihat.

Tahap isolasi jaringan; untuk mengisolasi jaringan sel darah putih, maka darah yang masih memiliki komponen-komponen lengkap perlu dipisahkan satu dengan lainnya sehingga yang tersisa hanya sel darah putih. Karena itu ke dalam tabung yang berisi darah diberikan larutan pelisis sel darah merah yang merupakan larutan hipotonis. Karena larutan tersebut hipotonis, maka akan terjadi hemolisis. Larutan pelisis sel darah merah terdiri atas EDTA (ethylenediamine tetraacetic acid) yang akan membentuk kompleks (chelate) dengan ion logam, seperti Mg²⁺ yang merupakan kofaktor DNAse. Selanjutnya tabung dibolak-balik dengan gerakan memutar yang membentuk angka 8 agar larutan dapat menyatu dengan sempurna selama 10 menit. Darah yang telah bercampur dengan pelisis sel darah merah tersebut lalu disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 2500 rpm. Selanjutnya supernatan yang terbentuk dibuang. Untuk melisiskan membran sel dan membran nukleus sel darah putih yang terisolasi tadi, diberikan larutan pelisis sel darah putih yang terdiri atas EDTA dan SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) yang berfungsi untuk merusak lipid pada membran sel sehingga leukosit hancur.

Tahap selanjutnya yaitu purifikasi. Purifikasi bertujuan untuk membersihkan sel darah putih dari zat-zat lainnya; Ke dalam larutan tadi kemudian diberikan RNAse dan diinkubasi selama 15 menit pada suhu 37°C. Hal tersebut bertujuan untuk mengoptimalkan kerja enzim yang sangat dipengaruhi oleh temperatur. Tahap berikutnya yaitu presipitasi; Tahap presipitasi dilakukan dengan cara meneteskan larutan presipitasi protein dan kemudian divortex yang bertujuan untuk menghomogenkan larutan. Larutan presipitasi protein terdiri atas amonium asetat yang jika berikatan dengan protein mengakibatkan terbentuknya senyawa baru yang memiliki kelarutan yang lebih rendah, sehingga menyebabkan protein mengendap. Larutan tersebut kemudian disentrifugasi kembali selama 15 menit dengan kecepatan 3000 rpm. Supernatan yang berisi DNA kemudian dituangkan ke dalam tabung berisi isopropanol dingin dan tabung dibolak-balik kembali dengan gerakan angka 8. Pemberian isopropanol bertujuan untuk visualisasi DNA. Selanjutnya tabung disentrifugasi kembali selama 5 menit dengan kecepatan 3000 rpm.

Hasil dari sentrifugasi adalah terdapatnya pelet DNA pada dasar tabung yang kemudian ditambahkan etanol 70% dan dibolak-balik kembali. Pemberian etanol bertujuan untuk membersihkan DNA dari pengotor-pengotornya. Setelah tercampur, tabung kemudian disentrifugasi kembali selama 5 menit dengan kecepatan 3000 rpm. Hasil akhirnya adalah DNA yang berada pada tepi dasar tabung. Langkah akhirnya adalah dengan pemberian Tris-EDTA yang bertujuan untuk melarutkan kembali DNA untuk dipreservasi.

      Isolasi DNA Bakeri

Untuk mengisolasi komponen makromolekular dari bakteri, kita harus melakukan tiga hal. Pertama, kita harus merusak dinding sel dari bakteri dan membrane selnya untuk membantu ekstrasi dari komponen yang kita kehendaki. Kedua, harus bekerja pada kondisi yang baik hingga dapat menghambat atau menghacurkan turunan enzim yang dihasilkan dalam perusakan bakteri. Ketiga, harus menggunakan prosedur pemisahan yang menghasilkan makromolekul yang kita kehendaki.

Prosedur kerja isolasi DNA bakteri berdasarkan eksperimen dari Makmur pada tahun 1961 adalah sebagai berikut.

Sel-sel bakteri dirusak dengan perlakuan awal dengan enzim putih telur, lisosim yang menghidrolisis dinding bakteri. Hasil dari melemahnya dinding sel bakteri adalah mudahnya memberikan kejutan osmotic. Akhirnya dinding sel bakteri akan mengalami lisis dalam lingkungan hipotonik.

Penambahan deterjen yang mengandung natrium dudocyl sulfat atau SDS akan melengkapi lisisnya bakteri dengan merusak residu membran bakteri. SDS juga menhambat aktivitas enzimatis yang berbahaya seperti nukleasis dibandingkan reaksi denaturasi dari deterjen.

Agen pengkhelat sitrat dan EDTA lebih jauh menghambat nukleolisis dengan mengembalikan ion logam divalen yang diperlukan untuk aktivitas inti. Metode eksperimen ini menggunakan beberapa macam metode pemisahan yang dapat memurnikan DNA yang terdapat pada sel bakteri. Secara khusus ion perklorat dapat memisahkan protein dari DNA. Kemudian kloroform isoamyl alkohol digunakan untuk denaturasi protein lebih jauh untuk sentrifugasi yang berbeda. Kemudian DNA akan diubah secara selektif selama penambahan etanol yang membuat menggulungnya serat panjang DNA dari makromolekul yang lain misalnya RNA dan protein yang terkoagulasi dalam bentuk nonserat. DNA kasar yang diperoleh, akhirnya dilarutkkan dan direpresipitasi dengan isopropanol di bawah kondisi yang hanya mendukung persipitasi DNA.